选择溶剂强度配制成合适的流动相可以提供理想的 k ′值。一个有经验的高效液相色谱仪工作者会控制在 1＜ k ′＜10 的范围（特殊情况下也允许 0.5＜ k ′＜20）。如果有良好的 R 值，短的分析时间，高的 N 值，往往能够检测出窄的色谱峰。可以作为液相色谱流动相使用的溶剂有 100 多种，但实用的只有少数几种。在实验室中有了甲醇、乙腈、水、四氢呋喃、正乙烷、二氯甲烷，就能够解决 90%以上的色谱分离问题。改变峰位（a 值）在反相色谱中常用两种“活性”溶剂──甲醇、乙腈和四氢呋喃。不同溶剂配比会影响分离效果，再用第三种溶剂调节流动相强度（反相液相色谱用水），充分显示出流动相的多样性和灵活性。
色谱柱和流动相确定后，为了获得满意的色谱分离，可进一步选择柱长、粒径和流速等。需要指出的是某些样品在进样前要进行很完全的预处理，另外，许多样品则需要进行梯度洗脱，当色谱条件有所改变时，需要寻找更合适的分离条件。
最后，需要强调的是所有这些讨论的前提是所建立的高效液相色谱仪方法必须满足精密度、准确度要求，并建立实验室之间方法实施的严格标准。对于选择方法的准确度和精密度有特定要求时，严格控制常规操作尤其重要。
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